Koncepce Národní banky osiva a explantátů lesních dřevin
Národní banka osiva a explantátů lesních dřevin zahrnuje dvě samostatná účelová zařízení provozovaná VÚLHM – Národní banku osiva lesních dřevin a Národní banku explantátů lesních dřevin. Každá banka má svůj statut a vlastní metodiku. Další informace se týkají pouze Národní banky explantátů lesních dřevin.
I. Statut Národní banky explantátů lesních dřevin
Čl. 1
Základní ustanovení
Národní bankou explantátů lesních dřevin (dále jen „banka explantátů“) je trvalé účelové zařízení, provozované VÚLHM, dlouhodobě uchovávající explantáty lesních dřevin ve specifických podmínkách, ve kterém je reprodukce genetických zdrojů zajišťována mikropropagačními postupy, s cílem zachovat tyto zdroje v podmínkách ex situ v co nejširší genetické variabilitě pro jejich budoucí reprodukci.
Čl. 2
Charakteristika uchovávaných explantátů
- Explantáty se odvozují od vybraných ortetů a klonů vykazujících vhodnou genetickou skladbu pro zachování a reprodukci genetických zdrojů lesních dřevin a pro výzkumné a šlechtitelské účely.
- Reprodukční materiál uchovávaný v bance explantátů musí splňovat podmínky stanovené příslušnými právními předpisy.5, 6, 7, 8
- V bance explantátů se uchovávají zejména oddíly populací a jedinců těch druhů dřevin, jejichž generativní reprodukce je omezená, nebo se jedná o uchování zvláště cenných či ohrožených (např. endemitních, reliktních), případně dalších významných genotypů lesních dřevin.
Čl. 3
Účel využití uchovávaných explantátů
- Explantáty lesních dřevin jsou určeny pro:
- udržení biodiverzity lesních ekosystémů,
- šlechtitelské účely, potřeby lesnického výzkumu a vzdělávání,
- účely naplnění mezinárodních smluv týkajících se genetických zdrojů, jimiž je Česká republika vázána, včetně poskytování vzorků na základě dodržení principu vzájemného poskytování stejných nebo obdobných výhod,
- namnožení za účelem realizace projektů na zajištění návratu reprodukčního materiálu populací lesních dřevin do míst jejich původního výskytu nebo na jiná vhodná stanoviště schválených ÚHÚL (§ 4 odst. 2 písm. d) vyhlášky č. 132/2014 Sb.).
- Využití uchovávaných explantátů lesních dřevin koordinuje ÚHÚL podle § 30 odst. 2 písm. a) zákona č. 149/2003 Sb.
Čl. 4
Organizační a technické zabezpečení banky explantátů
- Banka explantátů je umístěna na vyhrazeném a označeném místě, je příslušně technologicky vybavena a zabezpečena.
- Banka explantátů a uchovávané explantáty jsou majetkem VÚLHM.
- Finanční prostředky na provoz banky explantátů jsou pro účely stanovené zákonem č. 149/2003 Sb. poskytovány VÚLHM ze státního rozpočtu prostřednictvím kapitoly ministerstva.
- VÚLHM:
- koordinuje a zajišťuje získávání vzorků genetických zdrojů do banky explantátů, zařazuje vzorky genetických zdrojů do banky explantátů, vede řádně jejich evidenci a garantuje jejich identitu,
- zajišťuje uchovávání oddílů explantátů ve vhodných podmínkách tak, aby nedošlo k jejich poškození nebo zničení,
- provádí jednou ročně hodnocení a inventarizaci vzorků genetických zdrojů v souladu s příslušnými právními předpisy,5, 8
- vede průběžně dokumentaci o oddílech explantátů uložených v bance explantátů v souladu s příslušnými právními předpisy,5, 8
- poskytuje vzorky genetických zdrojů v souladu s příslušnými právními předpisy,5, 8
- zajišťuje v případě zjištění nebezpečí znehodnocení genetických zdrojů lesních dřevin nezbytná opatření k jejich záchraně podle § 2b odst. 2 písm. d) zákona č. 149/2003 Sb.,
- oznamuje při ohrožení genetického zdroje lesních dřevin tuto skutečnost ÚHÚL podle § 2b odst. 3 zákona č. 149/2003 Sb.
II. Metodika Národní banky explantátů lesních dřevin
Banka explantátů uchovává a reprodukuje genetické zdroje lesních dřevin mikropropagačními postupy standardizovanými podle růstových požadavků specifických pro jednotlivé druhy.
MATERIÁL
Banka explantátů uchovává klony lesních dřevin v podmínkách in vitro.
Uchovávané explantáty jsou odvozeny:
- od zvláště cenných či ohrožených, případně dalších významných populací a jedinců,
- od populací a jedinců s omezenou generativní reprodukcí.
V bance explantátů je dlouhodobým cílem uchovávat minimálně:
- 30 klonů, jedná-li se o populace vtroušených druhů dřevin,
- v případě zvláště cenných či ohrožených (např. endemitních, reliktních), případně jinak významných dřevin, pokud je počet jedinců na stanovišti nižší než 30, co největší možný počet klonů,
- 30–100 klonů v ostatních případech.
STRUKTURA ZÁSOB ULOŽENÝCH ODDÍLŮ EXPLANTÁTŮ
Každý oddíl explantátů skladovaný v bance explantátů se skládá z následujících částí:
Základní část oddílu explantátů – explantáty pěstované za standardizovaných optimálních podmínek in vitro v prostorově oddělené klimatizované místnosti. Od jednoho klonu jsou dlouhodobě uchovávány minimálně 3 explantáty.
Aktivní část oddílu explantátů – explantáty pěstované za standardizovaných optimálních podmínek in vitro za účelem revitalizace a namnožení genetického zdroje pro účely náhrady základního oddílu nebo pro poskytování vzorků.
Pracovní část oddílu explantátů – explantáty pěstované za standardizovaných optimálních podmínek in vitro pro účely výzkumu a šlechtění a pro účely projektů, jimiž plně disponuje pouze jejich majitel (šlechtitel, řešitel projektu apod.).
Bezpečnostní duplikát základní části oddílu – explantáty pěstované za snížené teploty a intenzity osvětlení (využití metod tzv. zpomaleného růstu explantátů) po dobu standardizovanou pro jednotlivé druhy dřevin. Od jednoho klonu jsou uchovávány minimálně 3 explantáty.
Kryokonzervované části oddílů explantátů – vzácné genotypy dlouhodobě uchovávané metodou kryokonzervace u druhů dřevin, pro které budou na základě výsledků výzkumu získány vyhovující kryoprotokoly.
SBĚR
Sběr pro indukci organogeneze provádí VÚLHM obvykle na začátku (březen až duben), či konci (říjen až listopad) vegetační doby. Z jednoho ortetu se odebírá cca 30 dormantních pupenů. Pro indukci somatické embryogeneze se sbírají specifické části rostlin podle metodiky vypracované pro jednotlivé druhy. Z jednoho stromu se odebírá cca 30 specifických částí rostlin. Vzorky při odběru se ukládají odděleně v obalech zabraňujících vysychání. Každý obal se nezaměnitelně označí. Stromy jsou před sběrem označeny a jejich poloha je zaznamenána do porostní mapy.
ZPRACOVÁNÍ A UCHOVÁVÁNÍ ROSTLINNÉHO MATERIÁLU
Odebraný rostlinný materiál je zpracováván standardními mikropropagačními postupy (organogeneze nebo somatická embryogeneze) v kontrolovaných podmínkách podle vypracovaných standardizovaných, případně certifikovaných metodik pro jednotlivé druhy.
ORGANOGENEZE
Princip: spočívá v indukci morfogenetických pochodů v kompetentních pletivech primárního explantátu.
Odběr rostlinného materiálu: meristematická pletiva se odebírají z ortetů na konci a začátku dormance.
Indukce organogeneze: explantáty se pěstují v kontrolovaných, sterilních in vitro podmínkách na živných mediích obsahujících definované koncentrace fytohormonů vhodných pro indukci morfogenetických pochodů.
Multiplikace: po vytvoření nových prýtů se explantáty dělí a přesazují v pravidelných intervalech na sterilní čerstvá živná media k dosažení požadovaných počtů explantátů.
Indukce rhizogeneze: pro zakořeňování se explantáty převádějí na sterilní živná média obsahující definované koncentrace fytohormonů, vhodných pro indukci růstu adventivních kořenů.
Dlouhodobé uchovávání explantátů: multiplikující se explantáty se kultivují za snížené teploty a intenzity osvětlení po dobu standardizovanou pro jednotlivé druhy dřevin. Následná regenerace explantátů vyžaduje přesazení do kultivačních místností se standardními podmínkami pro multiplikaci explantátů. Po namnožení lze explantáty využít k dopěstování kompletních rostlin nebo mohou být opět uchovávány za snížené teploty a intenzity osvětlení.
Aklimatizace a výsadba na venkovní plochy: zakořeněné explantáty se převádějí do nesterilních substrátů a aklimatizují se v kontrolovaných kultivačních podmínkách. Po aklimatizaci se mikropropagované výpěstky vysazují do venkovních podmínek.
SOMATICKÁ EMBRYOGENEZE
Princip: spočívá v indukci růstu a diferenciaci embryogenních pletiv.
Odběr rostlinného materiálu: generativní i somatické orgány se odebírají z rodičovských stromů či ortetů v průběhu vegetační doby.
Indukce embryogenních procesů v rostlinném pletivu: explantáty se pěstují v kontrolovaných, sterilních podmínkách na živných médiích obsahujících definované koncentrace fytohormonů vhodných pro indukci embryogenních pletiv.
Indukce proliferace, diferenciace a maturace embryogenních pletiv: změnou kultivačních podmínek jsou navozeny proliferace, diferenciace a maturace somatických embryí.
Konverze somatického embrya v kompletní rostlinu: chladovou fází, desikací, případně úpravou dalších podmínek se indukuje konverze embryí, další růst kompletních rostlin již probíhá v nesterilních podmínkách.
Aklimatizace a výsadba na venkovní plochy: probíhá stejně jako v případě organogeneze.
KRYOKONZERVACE (KRYOPREZERVACE)
Kryokonzervace vegetativně množených rostlin nebo částí semen je metoda pro jejich uchování v nízkých nebo ultra nízkých teplotách navozením tzv. skelného stavu, při kterém je obsah vody v rostlinných buňkách významně snížen způsobem, kdy nedochází k jejich nevratnému poškození, zejména tvorbou krystalů vody při zmrazování vzorků v teplotách kapalného dusíku (–196 °C).
Pro dlouhodobé uchovávání rostlinného materiálu jsou vhodná embryogenní pletiva, vegetativní části rostlin s meristematickými buňkami (např. vzrostné vrcholy, plumula, úžlabní pupeny).
Metody kryokonzervace jsou postupně vyvíjeny a optimalizovány pro jednotlivé druhy dřevin. Kryoprotokol pro příslušný rostlinný druh je založen zpravidla na použití postupů vitrifikace a enkapsulace nebo přímého uchování ortodoxních semen v kapalném dusíku. Tyto postupy jsou výhodné pro dlouhodobé uchování genetické informace a současně zaručuje in vitro regeneraci metodou organogeneze nebo somatické embryogeneze.
Pro umožnění aplikace vitrifikačního a enkapsulačního kryoprotokolu je součástí biotechnologie i specifikace postupu mikropropagace metodami organogeneze a somatické embryogeneze zacílená v případě organogeneze na podporu iniciace tvorby výhonů ve fázi multiplikace.
Při využívání metody kryokonzervace spolupracuje banka explantátů s bankou osiva.
EVIDENCE
Každý explantát je označen tak, aby v průběhu uchovávání byla kdykoli možná jeho jednoznačná identifikace.
Označení explantátu zahrnuje identifikační údaje o zdroji, složení kultivačního média a stáří explantátu. Jakákoli změna týkající se počtu a kvality explantátů jednotlivých klonů musí být evidována.
Evidence je vedena v digitální i analogové podobě. V případě vyřazení genetického zdroje z banky osiva a explantátů budou veškeré analogové dokumenty archivovány po dobu 10 let.
METODICKÉ POSTUPY V BANCE EXPLANTÁTŮ
Metodické pokyny banky explantátů podrobněji rozvádějí technické a věcné podrobnosti o postupech a materiálech, sběru, zpracování, zjišťování kvality, uchovávání, evidenci a použití explantátů jednotlivých dřevin. Metodické pokyny pro jednotlivé dřeviny jsou obsaženy v příslušných standardizovaných, případně certifikovaných metodikách vypracovaných na pracovišti VÚLHM:
Druhy listnatých dřevin, pro které byly na pracovišti NBELD standardizovány, příp. certifikovány metodické postupy jejich uchovávání v podmínkách in vitro
* Standardizované postupy, u kterých se v budoucnu předpokládá certifikace
** Pouze metoda somatické embryogeneze
Metodické postupy pro ověřování klonální identity lesních dřevin v semenných sadech a směsích klonů pomocí analýz DNA:
VÚLHM vydává Metodické pokyny banky explantátů, které budou podrobněji rozvádět technické a věcné podrobnosti o postupech a materiálech, odběru, zpracování, zjišťování kvality, uložení a uchovávání, evidenci a použití explantátů jednotlivých dřevin.
Za účelem systematického naplňování banky explantátů VÚLHM vydá, případně aktualizuje strategii individuálního výběru zdrojů reprodukčního materiálu lesních dřevin vhodných pro uložení.
Zákon č. 149/2003 Sb., o uvádění do oběhu reprodukčního materiálu lesních dřevin lesnicky významných druhů a umělých kříženců, určeného k obnově lesa a k zalesňování, a o změně některých souvisejících zákonů (zákon o obchodu s reprodukčním materiálem lesních dřevin), ve znění pozdějších předpisů.
Vyhláška č. 29/2004 Sb., kterou se provádí zákon č. 149/2003 Sb., o obchodu s reprodukčním materiálem lesních dřevin, ve znění pozdějších předpisů.
Vyhláška č. 393/2013 Sb., o seznamech druhů lesních dřevin.
Vyhláška č. 132/2014 Sb., o ochraně a reprodukci genofondu lesních dřevin.
Uvedená koncepce byla schválena v rámci Národního programu ochrany a reprodukce genofondu lesních dřevin na období 2019–2027 dne 17. 12. 2018. Níže jsou uvedeny doplňující publikace zpracované po schválení koncepce v rámci pokračujícího výzkumu a průběžného získávání nových poznatků.
2018:
Cvrčková H., Máchová P., Trčková O. 2018. Využití mikrosatelitových markerů pro hodnocení genetické diverzity smrku ztepilého. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 6: 35 s.
Novotný P., Dostál J. 2018. Metodika ověřování deklarovaného původu klonů v semenných sadech na principu molekulárně-genetických analýz. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 11: 39 s.
Pokorná E., Faltus M., Máchová P., Semerák M., Zámečník J. 2018. Metodika pro bezpečné uchování in vitro kultur topolu šedého (Populus ×canescens Aiton Sm.) v ultra-nízkých teplotách. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 5: 24 s.
2019:
Cvrčková H., Máchová P., Trčková O. 2019. Využití mikrosatelitových markerů pro ověřování klonové identity a diverzity u lípy srdčité (Tilia cordata Mill.). Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 4: 36 s.
Pokorná E., Komárková M., Fulín M., Máchová P., Cvrčková H. 2019. Metodický postup určení genotypů dubů s využitím jaderných mikrosatelitových markerů. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 6: 31 s.
2020:
Cvrčková H., Máchová P., Trčková O. 2020. Určování klonově identických jedinců modřínu opadavého (Larix decidua Mill.) a sledování jejich diverzity na základě analýz u mikrosatelitových markerů. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 3: 36 s.
Pokorná E., Komárková M., Cvrčková H., Máchová P., Bajajová H. 2020. Využití biochemických metod při identifikaci topolů odolných vůči suchu. Certifikovaná metodika. Lesnický prúvodce, 1: 28 s.
2021:
Cvrčková H., Máchová P., Trčková O. 2021. Metodické postupy ověřování genetické diverzity a klonové identity u břízy bělokoré (Betula pendula Roth.) s využitím mikrosatelitových markerů. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 4: 32 s.
2022:
Cvrčková H., Čížková L., Máchová P., Vítová K. 2022. Metodické postupy charakterizace genetické diverzity u topolu černého (Populus nigra L.) s využitím mikrosatelitových markerů. Certifikovaná metodika. Lesnický průvodce, 8: 34 s.